CRISPR技術的發現帶來了一種高效、可靠、方便的基因組編輯工具的希望。但是，過去用Cas9靶標多個基因組位點需要構建多個或者很大的表達載體，CRISPR-Cas9編輯技術的應用具有一定的局限性。而多重基因組編輯技術可以高精度的修改基因組中兩個或多個特定的DNA位點，大大增加了在多個核苷酸水平上向目標基因組引入突變的可行性。

CRISPR核酸酶和向導RNA(gRNA)被用來在基因組中引入雙鏈斷裂(DSB)，基因組編輯的準確性和效率受到細胞DSB修復途徑的影響，這些修復途徑包括同源定向修復(HDR)、非同源端連接(NHEJ)、微同源介導的末端連接(MMEJ)等^[1]。NHEJ是大多數真核生物修復DSB的主要細胞修復途徑，但常常因能引入indel從而導致移碼突變；而HDR通常使用姐妹染色單體作為同源修復模板來精準修復攜帶DNA斷裂的染色體，從而實現精確的基因組編輯(PGE)，但效率比較低。

德國馬克斯普朗克進化人類學研究所研究人員Stephan Riesenberg等人分享一種基于CRISPR-Cas9的多重基因組編輯，利用PRKDC基因突變和激酶抑制劑M3814抑制DNA依賴性蛋白激酶的催化亞單位(DNA-PKcs)活性，增加基因編輯HDR效率，使得在同一個細胞中同時精確編輯多達4個基因的方法^[2]。

人類細胞PRKDC基因的

K3753R突變可促進HDR

為了提高靶向DSB的基因編輯效率，減少DSB的脫靶可能，建立人誘導多能干細胞(hiPSC)細胞系{在含Matrigel Matrix (Corning, 35248)的板中培養，培養基為每天更換補充劑 (StemCell Technologies, 05852) 的mTeSR1 培養基 (StemCell Technologies, 05851)}，攜帶D10A突變的強力霉素誘導型Cas9(iCRISPR-Cas9n)，使其誘導DNA單鏈斷裂^[3]。hiPSC引入編碼DNA-PKcs蛋白的PRKDC基因的K3753R突變，致其失活，對比DNA-PKcs K3753R(KR)和DNA-PKcs野生型(WT)細胞中引入核苷酸替換的效率。

設計gRNAs和14種單鏈寡脫氧核苷酸供體(ssODNs)，強力霉素誘導Cas9n表達，轉染gRNAs和ssODN。培養3天后分離DNA，PCR擴增目標基因并測序，鑒定ssODNs通過HDR插入靶標基因的效率。當單獨編輯每個基因時，WT細胞中的HDR頻率在14個基因中變化在4%到40%之間(平均18%)(圖1A)；在KR細胞中，頻率在15%到81%之間(平均51%)(圖1B)。在這些基因中，KR細胞的HDR增加了1.6倍到6.8倍(平均3.3倍)(圖1C)。在KR細胞中，MMEJ相對于NHEJ增加(圖1D)，NHEJ被抑制，導致HDR急劇增加(圖1E)。

圖1：失活DNA-PKcs可促進HDR

選取KR細胞中HDR頻率低的3個基因，使用Cas9替代Cas9n，其中兩個基因的HDR分別從35%和20%增加到73%和87%(圖2A)。因此，對于一些MMEJ占主導的靶點，可以通過使用不同的核酸酶提高PGE，以基因VCAN中Cas9n和Cas9編輯后的缺失模式為例，不同的切割位點，導致HDR頻率的不同(圖2B)。

圖2：不同核酸酶在KR細胞系中HDR頻率變化

為了測試在hiPSCs中看到HDR的增加是否依賴于細胞類型或使用的酶，基因編輯HEK293細胞{(ECACC, 85120602)，培養基為含 10% 胎牛血清 (FBS) (SIGMA, F2442) 和 1%NEAA(SIGMA, M7145）的Dulbecco 改良 Eagle 培養基/F-12 (Gibco, 31330-038)}和K562細胞{(ECACC, 89121407) ,培養基為含10% FBS的 Iscove 改良的 Dulbecco 培養基 (ThermoFisher, 12440053)}，在單細胞打印機分選基因編輯后的單克隆細胞，進行文庫制備和Illumina測序。分別對比在KR和WT中使用不同核酸酶Cas9n、Cas9和Cpf1的基因組編輯頻率情況。可以發現在不同細胞系、不同核酸酶下，DNA-PKcs蛋白的PRKDC基因的K3753R突變都會引起HDR頻率的增加（圖3）。

圖3：不同DNA-PKcs K3753R細胞系能促進HDR

將四種不同基因的成對組合在誘導Cas9n表達后電穿孔到iPSC的KR細胞中。409-B2 iCRISPR-Cas9n hiPSC 在編輯前三到四天在含有 2 g/ml 強力霉素 (Clontech, 631311) 的培養基中孵育。對于多重精確基因組編輯，在電穿孔前一天將該培養基更換為含有補充劑 (Gibco, A3349401)、CloneR (StemCell Technologies, 05888) 和強力霉素的 StemFlex。90% 的電穿孔細胞被鋪板用于批量基因型分析，10% 的 hiPSC 被鋪板在6 孔板中以產生源自單細胞的克隆，在電穿孔后 2 天，培養基中添加了 ROCK 抑制劑 Y-27632。至少 7 天后，挑選單克隆用于后續繁殖和 DNA 分離。當同時編輯兩個基因時的HDR頻率都與對應基因的單編輯相似或略低(圖4A)；對于三個基因的三種不同組合，HDR效率平均比單個編輯低三分之一，導致每個目標位點的平均編輯頻率為40%(圖4B)；對于4個或5個基因，平均HDR頻率分別下降到13%和8%(圖4C)。此外，細胞存活率從2次編輯的30-68%下降到5次編輯的11%(圖4E)。

對于三重編輯，分選的單細胞來源的克隆(SCCs)中大約有三分之一以純合子的形式攜帶所有目標基因(6條染色體)；四重基因編輯的SCCs中有6%的4個氨基酸替換的純合子細胞克隆，比預期高出1000倍(圖4D)。這表明，具有“編輯能力"的細胞往往會在多個位點上被有效編輯。

圖4：利用失活DNA-PKcs細胞系進行多重精確基因組編輯

表達失活的DNA-PKcs的細胞

的基因組穩定性不受影響

為了驗證失活409B2-iCRISPR iPSC的DNA-PKcs催化活性是否導致基因組不穩定，使用Trypsin-Giemsa Banding(GTG)試劑和光譜核型分析(SKY)核型分析，顯示KR-KCS克隆中觀察到一個多倍體中期染色體(圖5B)。此外，用DSB誘導藥物博萊霉素處理表達WT和KR細胞，KR細胞比WT細胞的存活率降低高兩倍(圖5C)。經博萊霉素處理后，50個WT細胞中有4個中期染色體出現不平衡易位，50個KR細胞中有2個中期染色體出現平衡易位。因此，與WT細胞相比，KR細胞的非整倍體或染色體重排沒有增加(圖5D)。

為了評估其他類型的遺傳不穩定性，對DNA-PKcs WT、WT細胞傳代48次后生成KR克隆、KR細胞傳代24次后生成三編輯克隆KR-KSC(KATNAI-SLITRKI-CALDI編輯)(圖5A)進行全基因組測序。比較沿著染色體1mb基因組覆蓋率，與WT相比，KR和KR-KSC的差異是9號染色體覆蓋率下降，表明存在雜合缺失(圖5E)。全基因組測序結果發現在KR和KR- KSC細胞之間共有19個新的雜合單核苷酸變異(SNV)，在KR- KSC細胞中有3個新的雜合SNV；沒有發現三個細胞系之間的indel有什么不同。按全基因組結果推算，WT細胞傳代的突變率為21,KR細胞為7，證明KR以及KR-KSC均沒有提高突變的概率。

圖5：DNA-PKcs K3753R細胞的基因組穩定性

在KR細胞中提高核苷酸替換的效率，引入所需的改變后，恢復正常的DNA-PKcs功能成為可能，可以通過暫時抑制DNA-PKcs的激酶活性來增加HDR。M3814是一種新型高效的DNA-PKcs抑制劑，基因編輯的細胞在電轉后分別使用或不使用2 μM的M3814處理3天后，用單細胞打印機(Cytena)分選單克隆細胞，提取DNA進行PCR擴增，制作Illumina文庫并進行測序。

結果顯示，在WT K562細胞中Cas9誘導的DSB的HDR從18%增加到81%，同時表現出中等毒性，409B2 hiPSCs的HDR也出現了類似的增加(圖6A和6B)。與其他DNA-PK抑制劑相比，M3814使得HDR增加的效果更好(圖6C)。為了探索這種明顯的高編輯效率是否可能是由于誘導目標DNA序列的大量缺失，在無M3814和有M3814編輯后分離單克隆細胞，通過擴增子測序發現，當M3814未被使用時，10%的克隆以純合子狀態替換核苷酸；而使用M3814時，替換正確的克隆達到76%。另外，M3814同樣增加了多重基因組編輯的HDR(圖6D和6E)。因此，通過可逆性K3753R突變或M3814抑制DNA-PKcs的激酶活性，可以顯著增加PGE，允許在人類細胞中同時引入多個核苷酸替換。

圖6：小分子M3814對DNA-PKcs瞬時失活的影響

本篇文章展示人類細胞可以利用PRKDC基因的K3753R突變提高基因編輯中PGE的效率，并且可以和小分子M3814結合，進一步促進HDR。在這種方法下，沒有發現K3753R突變會降低基因組穩定性；在博萊霉素處理后易位更少，每次傳代的突變也更少。易出錯的NHEJ的損傷可能會導致細胞通過不易出錯的HDR更頻繁地修復DSB，否則細胞可能會發生凋亡，導致存活的細胞以更準確的形式維持其基因組。DNA-PKcs抑制劑M3814能夠在一定程度上增加HDR，與PRKDC突變可以達到相當的程度。DNA-PKcs失活會導致哺乳動物因無法進行V(D)J重組而產生嚴重的聯合免疫缺陷，因此M3814可以在基因治療中使用，提高HDR效率來實現治療目標。

基因編輯作為21世紀偉大的科學成就之一，具有廣泛的應用領域。為了獲得基因編輯成功的細胞株，需要在轉染后的細胞池中富集并克隆以創建統一的單克隆細胞系，以待進一步的表征。傳統的分選方法如有限稀釋法耗時耗力、效率低下；FACS分選的細胞容易受到鞘液壓力的影響而受損，導致單克隆率低。同時，這兩種方法都無法提供單細胞來源的證明，無法滿足監管部門的要求。

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