拉曼過程分析技術在細胞治療生物工藝中的應用
細胞療法在治療復雜疾病方面有著很大的貢獻。隨著越來越多的這類療法得到上市許可，其涉及到的生物工藝也越來越受到人們更多的關注，最近來自細胞與基因療法制造中心的B Marc-Olivier等人的研究中，使用拉曼光譜作為在線光學傳感器，檢測一個自體T細胞免疫治療模型的生物工藝過程，該過程在一個生物反應器中進行。通過使用標準生物學分析方法測定參考數據，開發了基于拉曼光譜的化學計量學模型，用于測定葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸鹽和氨的含量，使得對過程性能進行即時反饋成為可能。
介紹
在細胞療法生物過程中，根據設計質量原則(QbD)開發工藝。QbD的一個關鍵促成因素是實施過程分析技術(PAT)，在這里，作者展示了拉曼光譜在生物反應器系統中監測T細胞培養的應用。通過化學計量學建模，以in-line的方式實時追蹤代謝過程的多個標記物，并與以at-line方式測量的質譜和生物分析技術的測量結果相關聯。這些結果顯示，在細胞療法生物過程中實時在線監測的發展已經向前邁出了重要一步，這為提高細胞療法生物過程的一致性開辟了新的機會。
材料和方法
圖1 ：RamanRxn2原位收集拉曼光譜分析儀
來自四名健康獻血者的新鮮的外周血，分離CD4+/CD8+細胞的陽性T細胞，采用300ml微型生物反應器系統中進行T細胞活化和擴增。在每個實驗中，來自四個不同供體的T細胞庫平行培養12天。使用相同的四個T細胞庫進行了總共三次實驗。每天對生物反應器進行取樣測量葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸和氨濃度的離線參考數據。
拉曼光譜用RamanRxn2原位收集拉曼光譜分析儀采集(參見圖1)，配有四個不銹鋼浸入式探頭。拉曼探頭通過高壓滅菌進行消毒。激光器激發波長為785 nm，功率為400 mW，分辨率4cm-1。的光譜收集間隔：進行75次掃描，每次掃描10秒。
結果
所有T細胞培養物在 300 mL生物反應器中保持12天，該反應器包含拉曼光譜探頭和pH傳感器、溫度傳感器和DO傳感器。這些過程持續12天，第7天最后一次補料，以檢查細胞對耗盡的營養的反應。為了證明初代細胞材料常見的變異性，對來自四個獨立供體的白細胞分離材料進行T細胞計數，并在T細胞分離前后對CD4和CD8群體進行計數，供者之間輸入材料中的總T細胞計數在1.42×109到2.89×109之間變化。根據離線數據和模型輸出之間的相關性，對最佳模型擬合進行了如下排序：葡萄糖(R=0.987)、乳酸(R=0.986)、氨(R=0.936)、谷氨酰胺(R=0.922)和谷氨酸(R=0.829)。葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺的化學計量學模型與參考數據很好地相關，并準確預測了從第5天細胞代謝和增殖率開始增加以后，葡萄糖和谷氨酰胺的消耗和乳酸的產生。將與離線測量相關的誤差評估變異系數(CV)。葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺，谷氨酸和氨的CV分別為0.9%、1.1%、1.2%， 3.7%，和1.7%。細胞濃度的變異系數為4.0%，細胞活力的變異系數為1.3%。因此，在隨后的分析中觀察到的所有趨勢都是顯著的。拉曼化學計量學模型以良好的相關性跟蹤參考測量值，并顯示了該技術作為PAT傳感器的潛力(參見圖2，圖3)。
圖2 ：葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸和氨的化學計量學模型，顯示每24小時收集的參考生物分析儀測量值與連續拉曼化學計量學分析之間的相關性。顯示了所有四個供體的單個生物培養過程的數據。
圖3 ：與匹配的單變量拉曼模型相比，所有供體和所有運行的細胞濃度和活力的離散時間過程數據。
討論
生物反應器系統用于細胞治療的生物培養過程中，提供在線傳感器，可用于常規實時監測物理參數，如pH、溶解氧和溫度。然而，在培養系統中測量與細胞行為相關的生物學和功能參數要復雜得多。在本研究中，作者應用在線拉曼光譜作為光學傳感器，實時監測免疫治療生物過程中T細胞的代謝和增值。其主要目的是證明利用拉曼光譜監測營養物質(葡萄糖、谷氨酰胺)的消耗和與細胞代謝相關的標記物(乳酸、谷氨酸和氨)的產生是可行的。
本研究中提供的數據證明了在細胞療法生物過程中使用拉曼光譜儀實時監測細胞功能行為的潛力。這是第一份應用拉曼技術監測細胞療法生物模型中營養消耗和代謝物產生的報告。對這些關鍵參數進行實時測量的能力可以提供對工藝性能的即時反饋，并使拉曼光譜儀成為改進未來細胞治療制造工藝的一個有吸引力的PAT系統。
參考文獻
[1] Marc-Olivier, B. , Daniela, B. , Enas, H. , & Damian, M. . (2018). Application of raman spectroscopy and univariate modelling as a process analytical technology for cell therapy bioprocessing. Frontiers in Medicine, 5, 47.
