細胞間的差異存在于任何細胞群體中，此前對細胞機制的理解還依賴于對大量細胞群體的測定。現在人們普遍認為，總體平均值可能不代表單個細胞功能，因此需要用單細胞分辨率來解析細胞“組學”(例如，基因組學、表觀基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等)。近來，單細胞DNA和RNA測序的發展使其能夠以單細胞分辨率監測細胞譜系和細胞異質性。然而，即使是等基因細胞(即具有相同基因型的細胞)也可能表現出隨機的細胞異質性。代謝產物和其他成分濃度的非遺傳性細胞差異會影響細胞死亡易感性、動力學，甚至是對統一致命藥物暴露的死亡模式。在癌癥治療中，連續幾輪細胞毒性化療通常會殺死腫瘤中一定比例的細胞，而不是絕對數量的細胞，這表明要么是預先存在的細胞異質性抑制治療，要么是細胞亞群對治療的選擇性反應，也就是說非遺傳細胞異質性對治療和治療的總體療效有明顯影響。
用單細胞分辨率檢測代謝物是很大的挑戰。在一個細胞內，有數千種獨特的化學物質以低濃度存在，且這些化學物質可以迅速變化，與單細胞基因組學和轉錄組學不同，代謝物沒有可用的擴增策略，若想獲得足夠的單細胞數據以統計區分細胞群體或亞群體之間的差異，高靈敏度，高的單細胞采樣吞吐量是必需的。流式細胞術是常用的單細胞測定技術之一，使用基于熒光的分子探針，以很高的通量(數千個細胞/秒)分析特定代謝物，但由于光譜特征重疊，流式細胞術只能同時測定大約十幾個分子。使用基于重金屬同位素的分子探針組合，流式細胞儀可以靶向多達48個不同的分子組分，但這仍然只代表單個細胞中存在的代謝物的一小部分。不幸的是，通過流式和質譜細胞術進行無靶向分子分析是不可行的，即研究人員必須事先知道并選擇要研究的分子。
質譜(MS)由于其高靈敏度、化學特異性和速度是適合非靶向單細胞分析的技術之一。目前已有幾種基于真空和探針的質譜技術，以實現對單細胞的全面、無靶化學分析，包括二次離子質譜(SIMS)、基質輔助激光/解吸電離(MALDI)和激光/解吸離子化(LDI)技術，這些技術雖然非常敏感，但需要在細胞的自然狀態之外對其進行重大修改(例如固定和脫水)，以便于在真空下進行分析。還有幾種方法，包括活單細胞質譜、單探針質譜和其他方法，使用手動引導的探針(移液器、光纖、毛細血管等)在原位或體內通過環境質譜測定細胞化學，然而，低采樣通量限制了大多數這些方法的使用，因為每個細胞的測定都很費時。
隨著技術的進一步發展，基于MS的技術成為快速、定量和非靶向單細胞化學分析所需技術的基礎。然而，單細胞化學的常規定量測定仍然具有挑戰性。此外，為了便于分析，目前的MS平臺需要廣泛的樣品制備程序或以其他方式干擾細胞的天然狀態，這可能會對細胞化學產生不可預見的影響。為了解決這些問題，此報道開發了一種新的單細胞化學分析能力，利用單細胞液滴分配，然后用常壓溶劑萃取-MS方法進行化學分析。本文證明了單細胞打印機液體渦流捕獲MS（SCP-LVC-MS）系統可以高采樣通量定量測定單個微藻和哺乳動物細胞的脂質組學特征，并在分析之前不需要對細胞本身進行任何修飾。
SCP-LVC-MS技術的工作原理是通過SCP技術進行單細胞分離，然后將液滴捕獲到LVC-MS采樣探針中，一旦暴露于適當的溶劑中，細胞就被裂解、提取并通過MS進行分析。SCP是一種臺式自動液滴式細胞打印機，利用類似噴墨的分配原理與光學顯微鏡相結合，含有>1個或沒有細胞的液滴可以通過成像顯微鏡識別，并通過真空吸出，確保每滴噴出一個細胞，在實踐中，>95%的噴出液滴含有單個細胞。SCP系統放置在Sciex TripleTOF®5600+質譜儀的頂部(圖1d)，LVC探針連接在SCP系統的底座上(圖1c)。cartridge在LVC探針正上方1mm處對齊(圖1c)，確保探針捕獲所有用于分析的液滴。LVC-MS是一種利用連續流動液體溶劑萃取的常壓MS技術，LVC-MS技術使用同軸管設計，當在優化的溶劑和噴霧器氣體條件下操作時，在探針的采樣端保持穩定的液體渦流排放(圖1c)，與液體渦流表面接觸的分析物在幾秒鐘內被捕獲、提取并輸送到質譜儀的電離源。隨后，使用電噴霧電離(ESI)、大氣壓化學電離(APCI)或幾乎任何基于液體的電離源對分析物進行電離，并通過MS進行檢測。在該配置中，含有單個細胞的液滴朝著LVC探針落下，該探針位于液滴噴出部位的正下方(圖1b)，液滴被液體渦流捕獲，其中細胞在暴露于溶劑(例如甲醇、氯仿等)時，由于滲透壓的變化而破裂，細胞的內容物在運輸到質譜儀的電離源(~6s)，分析物分子被離子化，然后使用MS以非靶向(例如，飛行時間(TOF)-MS)或靶向(如，串聯MS)方式進行測定。由于LVC探針是連續工作的，探針是自清潔的，去除了從一個細胞到另一個細胞的信號攜帶，并且可以容易地確定溶劑離子或由介質引起的離子的背景測定。這種方法的獨特之處在于，細胞一直保持在其“自然”狀態(在這種情況下是在生長培養基中)，直到LVC-MS進行裂解和化學分析。此外，SCP-LVC-MS技術不需要分子標記或其他樣品制備方案，質譜儀和電離源的操作方式與通常用于測定細胞群體中細胞化學的直接注入ESI實驗的操作方式完全相同。
圖1：SCP-LVC-MS系統概述
為了評估SCP-LVC-MS系統測定單細胞化學圖譜的能力，作者使用了直徑約為5-15μm的CC-125野生型mt+[137c]ChRe微藻，在不稀釋或不對細胞懸浮液進行其他改變的情況下，將ChRe細胞懸浮液移液到SCP芯片中，放置在SCP分配器上，并調整液滴噴射設置，在1分鐘窗口內對9個細胞取樣時的總離子色譜圖(TIC)如圖2a所示，TIC中的每個信號尖峰對應于單個細胞的分析。該過程僅允許包含單個細胞的液滴落入LVC-MS探針中，在t=0.55分鐘時，細胞液滴噴射前后的噴嘴圖像(用“*”表示圖2a)分別如圖2b和c所示。收集同一細胞的TOF-MS以及三次SWATH-MS掃描，在TOF-MS光譜中觀察到數十個離散離子(圖2d)。圖2e-g是基于單獨的串聯質譜實驗和SWATH-MS掃描結果，在同一細胞的SWATH-MS質譜中可以觀察到相關分子的特征碎片離子。
圖2.ChRe微藻單細胞的SCP-LVC-MS分析
除此之外，SCP-LVC-MS技術也在其他類型細胞上得到了驗證，獲得了另外一種微藻EuGr以及HeLa細胞(源于宮頸癌癥的常用人類上皮細胞系)的單細胞質譜。將細胞懸液直接從其培養基或儲存介質(分別用于EuGr和HeLa細胞的HSM和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))移液到各自的SCP芯片中，并通過LVC探針進行采樣。除了稀釋HeLa細胞懸浮液之外，在分析之前的任何一個實驗中都沒有使用樣品制備(過濾、離心、固定等)。EuGr和HeLa實驗的TIC軌跡分別如圖3a和3b所示。EuGr細胞直徑約20μm，呈橢圓形(圖3d)，細胞的活性突出表明，它們從自然狀態一直到LVC探針捕獲點都沒有受到干擾，EuGr細胞的TOF-MS光譜如圖3g所示。單個HeLa細胞(直徑約15μm)的圖像和質譜分別如圖3f和3h所示。
圖3.Euglena gracilis和HeLa細胞的單細胞分析
這些數據共同突出了SCP-LVC-MS系統測定藻類和哺乳動物細胞類型的單細胞化學的能力。該過程除了稀釋之外沒有采取額外樣品制備措施，通過對每種培養基的空液滴進行采樣評估，發現幾乎沒有產生細胞中測定到的脂質信號，這表明脂質信號來自LVC探針中裂解的細胞，也表明用于稀釋的培養基在該m/z范圍(700-1000)內對單細胞質譜的影響通常可以忽略不計。
SCP-LVC-MS系統的獨特之處在于，相對于其他非靶向MS單細胞方法，能夠以高采樣吞吐量以非靶向方式測定單細胞。SCP-LVC-MS系統的可行性通過測定微藻及HeLa細胞在其天然生長培養基中的脂質組成被驗證。在單個細胞中觀察到大量的二酰基甘油基三甲基高絲氨酸(DGTS)、磷脂酰膽堿(PC)、單半乳糖基二酰基甘油(MGDG)和二半乳糖基甘油(DGDG)脂質。該文還進行了其他實驗以證實不同單細胞脂質存在明顯差異以及以單細胞分辨率解決細胞群體差異的能力。
綜上，本文獻報告了一種方法，該方法通過單細胞打印機技術和液體渦流捕獲質譜法（SCP-LVC-MS）的結合，無需額外的樣品制備程序（如分子標記），即可對細胞懸浮液中的單細胞進行無靶向、高通量和定量質譜分析。
參考文獻：
Cahill JF, Riba J, Kertesz V. Rapid, Untargeted Chemical Profiling of Single Cells in Their Native Environment. Anal Chem. 2019 May 7;91(9):6118-6126. doi: 10.1021/acs.analchem.9b00680. Epub 2019 Apr 19. PMID: 30955322.
